怎么构建基因表达载体_如何构建一个基因的过表达载体
2023-05-17 07:54:44 来源:互联网

1、当拿到一个基因的DNA片段后,就需要把它导入一个载体,一方面长期保存。


(资料图)

2、另一方面也需要以载体为媒介将基因导入受体细胞中。

3、基因表达载体的构建是基因工程的核心。

4、常用的载体有细菌质粒,噬菌体和动植物病毒。

5、其中质粒载体最常用。

6、所谓载就是一个很长的环状DNA,携带一些基因,可以导入细菌中自我复制,也可以从细菌中提取出来改造。

7、现在我们就需要把SUN片段连到一个载体,用VectorNTI打开,研究一下用哪个酶处理,这个载体需要用Sma1这个酶切开,然后用SUN连上,替换切下来的ccdb,这里要用到两个酶,一个Sma1限制性内切酶切开,一个DNA连接酶把新片段连上,植物转基因载体和这些酶都是非常常用的试剂。

8、载体构建好之后需要把它们导入大肠杆菌中复制,这里就要用到大肠杆菌的感受态了,十把构建好的载体和感受态混合,然后放到42度热水处理个1分钟,再冰上放个3分钟。

9、这时需要一些培养细菌的培养基来培养菌们,大肠杆菌这种菌很好养活,唯一需要注意的是,灭菌过后的培养基要小心保存。

10、把在冰上处理过的大肠杆菌放到培养基中培养一天,为了防止没有转入载体的菌也混进来,我们在载体上加入了一个抵抗抗生素的基因。

11、这样我们在培养基中加入这种抗生素,在里面就只有需要的大肠杆菌能生长了。

12、最后得到了上亿个携带着含有我们的SUN基因的载体的大肠杆菌,这时就需要把质粒再提出来。

13、实验室里提质粒需要用专门的试剂盒,也可以简化一下,先把菌液离心让菌沉淀,然后再用水把菌打散,然后煮沸1分钟再离心,取上清,上清中加乙醇让DNA析出,再离心让DNA沉淀,最后用水把DNA溶解。

14、这样提出来的DNA会有很多杂质以及细菌的基因组DNA。

15、扩展资料:目的基因与运载体结合:将目的基因与运载体结合的过程,实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。

16、如果以质粒作为运载体,要用一定的限制酶切割质粒,使质粒出现一个缺口,露出黏性末端。

17、然后用同一种限制酶切断目的基因,使其产生相同的黏性末端(部分限制性内切酶可切割出平末端,拥有相同效果)。

18、将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处。

19、首先碱基互补配对结合,两个黏性末端吻合在一起,碱基之间形成氢键,再加入适量DNA连接酶,催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键,从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来。

20、形成一个重组DNA分子。

21、如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合,形成重组DNA分子(也叫重组质粒)的。

22、参考资料来源:百度百科-基因表达载体。

本文就为大家分享到这里,希望小伙伴们会喜欢。

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